LCM是利用激光在顯微鏡下切割單細(xì)胞或小簇細(xì)胞的一種技術(shù),。目的是為獲取純的特異性的細(xì)胞用于診斷、預(yù)后及科研,。
1.獲得純細(xì)胞群的意義
由Virchow宣稱(chēng),，能代表疾病的基本的單位是細(xì)胞而不是組織。如果沒(méi)有一個(gè)可靠的單細(xì)胞分離方法就不能進(jìn)行充分的分析,。腫瘤或前腫瘤分子改變的精準(zhǔn)分析常常只需要檢測(cè)感興趣的細(xì)胞,。LCM具有精準(zhǔn)選擇的能力(Fig.1)。
Fig.1 (A) Cutaneous malignant melanoma with a prominent central group of melanocytes, as observed under light microscope prior to laser capture microdissection.(B) The central group of melanocytes has been removed without alteration to the adjacent tissue in this image following LCM.(C) An image of the group of isolated melanocytes following extraction.
2.程序概述
用顯微鏡找到感興趣的細(xì)胞區(qū)域(Fig.2.A),，將帶有粘性的熱彈力膜的離心管蓋直接放置于載玻片上的組織上(Fig.2.B),，近紅外激光器發(fā)射激光通過(guò)轉(zhuǎn)移膜及其感興趣的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移膜受熱并局部融化,，并迅速滲入組織空隙(Fig.2.C),，轉(zhuǎn)移膜冷卻后與所選擇的細(xì)胞形成聚合物,。加熱與冷卻只在幾毫秒內(nèi)完成，轉(zhuǎn)移膜與細(xì)胞的結(jié)合力要強(qiáng)于細(xì)胞與載玻片的結(jié)合力,。新聚合物形成后通過(guò)收縮與周?chē)M織脫離,，轉(zhuǎn)移膜可以移動(dòng)并獲取足夠的感興趣的細(xì)胞(Fig.2.D)。當(dāng)獲取細(xì)胞完成后,，聚合物移入0.5ml離心管,，管內(nèi)盛有裂解液或消化緩沖液(Fig.2.E)。
Figure2. Procedural Overview
3.標(biāo)本及處理
標(biāo)本類(lèi)型可以為多種：如石蠟包埋標(biāo)本,、冰凍標(biāo)本,、細(xì)胞或存檔的已經(jīng)染色并封片的標(biāo)本。不管是冰凍或是固定的標(biāo)本均應(yīng)快速操作以免被內(nèi)源性RNA酶,、核酸酶或蛋白酶所降解,。標(biāo)本固定后切片，厚度在5-10 um,，切片組織放在沒(méi)電荷,、無(wú)蓋玻片的載玻片上，再進(jìn)行后續(xù)的染色如HE染色,、IHC染色等等,。
4.系統(tǒng)組成
系統(tǒng)由以下幾個(gè)部分組成：LCM光學(xué)顯微鏡(Fig.3)、近紅外激光器,、電子控制系統(tǒng)(或帶控制手柄)的顯微鏡載物臺(tái),、相機(jī)具有實(shí)時(shí)顯微攝像功能、計(jì)算機(jī)系統(tǒng),。
Fig.3A. Leica laser capture microdissection system (LMD6000) (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). B. Artcurus laser capture microdissection system (PixCell) (Arcturus Bioscience Inc., Mountain View, California, USA).
5.激光及轉(zhuǎn)移膜的主要特點(diǎn)
膜的成分是由乙烯醋酸乙烯酯組成,，厚度為100um，膜的直徑是6mm,，該膜裝在透明管帽內(nèi),，聚合時(shí)容易從標(biāo)本上撤回(Fig.4)。該膜不會(huì)傳遞熱量至鄰近的細(xì)胞,，近紅外光與浸透至轉(zhuǎn)移膜內(nèi)的染料的吸收光譜十分相近,。
Fig.4. In this close-up of the Arcturus PixCell , the cap can be seen resting on the glass slide (Arcturus Bioscience Inc.,Mountain View, California, USA).
轉(zhuǎn)移膜下的組織能夠在幾微秒內(nèi)達(dá)到接近90℃。只有激光量子能夠使膜熔解并與其下的細(xì)胞粘附,、聚合(Fig.5),。激光的直徑能夠被調(diào)整從7.5-30um。激光能獲取不同大小的細(xì)胞或小簇細(xì)胞,。
Fig.5. The isolated cells are seen adherent to the transfer film in this scanning electron micrograph (Arcturus Bioscience Inc.,Mountain View, California, USA).
6. LCM細(xì)胞分離的優(yōu)點(diǎn)及局限性：
6.1優(yōu)點(diǎn)：耗時(shí)短的細(xì)胞分離方法,；能極其精準(zhǔn)的分離單個(gè)細(xì)胞，不損壞鄰近細(xì)胞,；細(xì)胞與膜的粘附緊密,、牢固,，不會(huì)損失細(xì)胞；能將細(xì)胞移離開(kāi)其原來(lái)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè),；低度進(jìn)展病變?nèi)缭錾?，也能被取樣?/span>
6.2局限性：固定的標(biāo)本如果脫水不充分或者冰凍組織在空氣下暴露時(shí)間太長(zhǎng)就很難被膜粘起；堅(jiān)硬的組織如骨組織及軟骨組織就不能應(yīng)用此方法,；如果所取的單細(xì)胞小于激光直徑7.5um就有可能取到鄰近的細(xì)胞,；花費(fèi)比手工顯微切割昂貴；沒(méi)有被激光照射的膜對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的非特異的弱引力,，新研制的蓋/膜系統(tǒng)并沒(méi)有直接接觸細(xì)胞便使這種情況的發(fā)生降到最低(Fig.6A-B)
Fig.6(A). Advanced cap/transfer films use built-in rails to suspend the transfer film just above the tissue. (B). When the film is struck by the laser beam, the transfer film melts and deforms to contact and bond to the underlying tissue (B). This cap minimizes the possibility of contamination by non-specific binding of unintended cells to the transfer film.
7.LCM的臨床應(yīng)用
7.1診斷
區(qū)分癌前病變及早期惡性腫瘤,、病理上難以區(qū)分的病變?nèi)绨螂兹轭^狀瘤與膀胱癌確定腫瘤組織起源如轉(zhuǎn)移性腫瘤的組織起源等。
7.2預(yù)后
預(yù)測(cè)侵襲性腫瘤的生物學(xué)行為,、未來(lái)的惡性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,、預(yù)測(cè)靶向治療的效用。
7.3藥物的發(fā)現(xiàn)
作為一個(gè)更大的分子數(shù)據(jù)庫(kù),，我們可能會(huì)找到一些藥物作用機(jī)制,。
7.4科學(xué)研究
通過(guò)檢測(cè)各種大分子的特征，識(shí)別正常,、癌前病變和惡性組織的遺傳差異,，提高了我們對(duì)疾病的整體認(rèn)知，將有助于未來(lái)的診斷,、預(yù)后評(píng)估和治療方式的選擇,。
（肝研所劉輝）
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