固定的意義一是停止細胞中的生化反應，固定其中的各種生化物質(zhì)狀態(tài)，防止分解；二是固定細胞形態(tài)，防止其變形或破裂。
固定劑的分類
固定劑分為醛類(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)、醇類(常用乙醇)、其它(丙酮)。
作用機制及用途
1.醛類(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)：
(1)4%中性甲醛：
原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。
用途：病理科用于診斷的病理組織常用此法固定。配制成10%中性甲醛(福爾馬林) 。
優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，組織收縮少。
缺點及注意事項：
①甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低,影響染色；因此縮短固定時間，降低固定溫度(4°C)，組織塊不宜過厚。
②分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露，可造成假陰性的染色結(jié)果。切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復)。
(2)戊二醛
原理：對于蛋白質(zhì)、核酸、多糖及細胞內(nèi)微管、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、紡錘絲、胞飲小泡、和細胞基質(zhì)固定良好。
用途：電鏡細胞化學研究。
優(yōu)點：穿透力強，可達4mm/h；固定后可在4度冰箱長期保存(數(shù)周-數(shù)月)；保存細胞微細結(jié)構(gòu)效果好。
缺點：
①對脂肪不起固定作用；
②不穩(wěn)定，易氧化。
(3)多聚甲醛
原理：通過與蛋白多肽鏈氨基酸側(cè)鏈的功能集團，使蛋白多肽分子間形成亞甲基橋(-CH2-)蛋白質(zhì)不再發(fā)生改變，保存原位。
用途：4%的多聚甲醛可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。1%的多聚甲醛可用于流式細胞術(shù)標本的固定。
優(yōu)點：對組織穿透性好，組織收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。
缺點：配制方法繁瑣，需要加熱及長時間攪拌。
2.醇類(常用乙醇)
(1)乙醇
原理：高滲透的小分子非極性物質(zhì)，其可以迅速滲透到細胞內(nèi)部，固定微細結(jié)構(gòu)，如糖蛋白、白蛋白，滲透力強。
用途：95%的乙醇可用于細胞爬片的固定；70%的乙醇可用于流式細胞檢測樣本的固定。
優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。
缺點：
①95%乙醇脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量,因而固定時間不宜過長(2小時內(nèi))。
②乙醇使蛋白變性程度輕，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育時間長的情況下，抗原可流失，并減弱反應強度。
3.其它
(1)丙酮
原理：溶解膜磷脂，所有的脂質(zhì)雙層(胞膜、核膜、細胞器膜等)將被破壞，但蛋白和多糖類不受影響。
用途：可用于細胞爬片的固定
優(yōu)點：
①丙酮兼有脫水的作用，固定后不需脫水
②可溶胞膜、核膜，如果染胞漿或胞核可不用或少用細胞打孔劑。
缺點：
①丙酮的揮發(fā)性很強，有毒，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制。
②需提前預冷處理，固定后結(jié)構(gòu)稍不完整。
③如果用孔板做，丙酮會將孔板溶掉。
(2)Bouin固定液：非常適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3)Carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細胞質(zhì)和細胞核，非凡適用于固定外膜致密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。
(4)Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標本，細胞核和細胞質(zhì)染色頗為清楚，但成本較高且需非凡處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學變化而失效。
(5)乙醚(或三氯甲烷)與乙醇等量混合對組織穿透性極強，即使涂片上含較多的黏液，固定效果仍較好，是理想的細胞固定液。
以上是對各種固定劑進行簡單匯總，希望各位科研人員在實驗中理清思路、避免混淆，根據(jù)不同實驗選擇合理的固定液。
(劉輝)
|
